胰岛素类药物的生物分析

网站首页 ꄲ 创新的德美 ꄲ 胰岛素类药物的生物分析

前言

糖尿病是由于胰岛素分泌及（或）作用缺陷引起的以血糖升高为特征的代谢病。糖尿病的典型症状是“三多一少”（多饮、多食、多尿、体重减轻）。目前，我国糖尿病分型是根据世界卫生组织在1999年的分型体系来划分的，有4种类型：1型糖尿病、2型糖尿病、特殊类型糖尿病、妊娠期糖尿病。1型糖尿病的主要病因是由于自身免疫对胰岛 β细胞破坏后造成胰岛素分泌的绝对缺乏，故 1型糖尿病患者需要胰岛素治疗来维持生命；2型糖尿病的发生是由于胰岛素分泌减少或胰岛素抵抗，可表现为以胰岛素抵抗为主伴胰岛素相对缺乏，或胰岛素分泌缺陷为主伴或不伴胰岛素抵抗。胰岛素类药物作为糖尿病治疗的常用药物，近年来得到了长足的发展。

胰岛素类药物的分类

胰岛素类药物根据其作用时间及特点分类如下[1]：

（1）速效人胰岛素类似物。利用重组DNA技术，通过修饰人胰岛素的氨基酸序列而生成的。如门冬胰岛素和赖脯胰岛素。

（2）短效胰岛素制剂，即普通胰岛素。目前有动物来源和重组人胰岛素。

（3）中效胰岛素，即低精蛋白锌胰岛素，是将胰岛素与锌和鱼精蛋白磷酸缓冲液混合制成的混悬剂。

（4）长效胰岛素制剂，即精蛋白锌胰岛素。

（5）超长效胰岛素制剂类似物，有甘精胰岛素和地特胰岛素，具有长效、平衡的特点，无峰值血药浓度。而德谷胰岛素作用时间长达42小时，注射时间灵活，间隔8-40小时均可。

（6）预混胰岛素，是含有短效和中效胰岛素制剂的混合物。

▲图1 胰岛素及其类似物的化学结构:(a)人胰岛素；(b)赖脯胰岛素；(c)甘精胰岛素；(d)门冬胰岛素；(e)地特胰岛素；(f)赖谷胰岛素；(g)德谷胰岛素[2]

胰岛素类药物国内外研究进展

▲图2 胰岛素类药物的发展史[3]

1889年，德国科学家发现移除狗的胰腺，会导致糖尿病，因此首次证明胰腺与糖尿病的相关性。其后从胰岛素的发现、动物胰岛素的提取、再到人胰岛素氨基酸序列的确定仅仅经历了不到五十年的时间。20世纪80年代至21世纪初，胰岛素的研究也经历了历史性的突破进展。通过基因工程技术规模化生产人胰岛素，后又通过对胰岛素结构的修饰或改变其理化性质，开发出了胰岛素类似物，使其更符合生理需要。与此同时，中国药企在胰岛素研究方面也取得了长足的发展。甘李药业、通化东宝、江苏万邦、珠海联邦、宜昌东阳光、合肥天麦等多家公司均在胰岛素赛道上取得不斐的业绩。

胰岛素类药物的代谢排泄

不同类型胰岛素在皮下的溶解、解离、扩散速度不同，导致起效时间、达峰时间、维持时间也有所不同。胰岛素皮下注射后在皮下形成储存池，偏酸性的胰岛素在人体生理偏碱性的环境中会在储存池中形成沉淀，并缓慢再溶解、释放，最终和外周细胞胞膜上的胰岛素受体结合[4]。

胰岛素类药物的代谢途径通常与内源性多肽的代谢途径相同，代谢产生的氨基酸在内源性氨基酸库中被重新利用，用于蛋白质/肽的从头合成。血液、肝脏、肾脏和小肠可能是胰岛素类药物降解的重要部位，因为它们富含各种蛋白酶和肽酶。但由于体内的蛋白酶和肽酶无处不在，体内其他各组织中也都存在多肽的降解。甘精胰岛素会被代谢成M1和 M2，其中M1是最主要的代谢产物。M1和M2均有较弱地与胰岛素样生长因子受体（IGF-1R）结合的能力。

通常情况下，胰岛素类药物的分子量通常都在10 kDa以下，可被肾小球过滤，然后在近端小管细胞刷状边缘被降解，其肾脏清除率接近肾小球的滤过效率。

胰岛素类药物的生物分析

胰岛素类药物的分析方法根据原理大致可分为三类：免疫分析法、色谱法和电化学生物传感器。免疫分析法包括ELISA, AlphaLISA, HTRF, CLIA，RIA等。色谱法包括MECC（胶束电动毛细管色谱法）和LC-MS/MS。电化学生物传感器是一种基于电流和/或电压检测分析物结合的类型。随着对胰岛素及其类似物或代谢物研究需求的增加，色谱方法也不断地发展，以实现胰岛素与其主要降解产物或其类似物药物之间的充分分辨。本文主要介绍色谱法分析胰岛素类药物。

表·1 基于色谱法的胰岛素测定方法综述[2]

色谱方法的机制是基于柱分离辅助高效液相色谱（HPLC）或电泳和鉴定使用紫外（UV）检测器和质谱（MS）。分析前不同的样品提取程序也为胰岛素测定提供了不同的选择性和敏感性。LC-MS/MS可用于定量生物基质中的治疗性蛋白/多肽和生物标志物。LC-MS/MS具有特异性高、选择性强、动态范围宽、抗干扰能力强等优点。一般来说，有两种方法来定量蛋白质：自上而下的方法用于研究完整的蛋白质，而自下而上的方法测量蛋白质的酶消化产生的肽。但使用LC-MS/MS检测胰岛素时存在运行时间长和分辨率低的缺点，而UPLC-MS/MS则解决了这个问题。还有文献报道[5]，与RIA相比，UPLC-MS/MS在检测甘精胰岛素及其代谢产物M1和M2时有更高的灵敏度和稳定性，同时还对内源性胰岛素、外源性胰岛素类似物的干扰具有较好的特异性优势。

UPLC-MS/MS方法的技术难点

该类项目对实验室质谱平台的综合能力提出了巨大挑战：

（1）首先是对于仪器系统整体性能、稳定性及灵敏度有很高要求，该类药物质谱多电荷带电，特殊的流动性条件致使信号响应低，所以仪器灵敏度要高且信号稳定，强吸附性需要仪器液相系统硬件有抗吸附功能，否则残留无法通过；

（2）该类化合物吸附性严重，在方法验证及样品分析过程中，仪器清洗维护至关重要，设备管理人员需要敏锐观测仪器信号稳定性，密切配合项目组及时清洗重要配件，才能保证项目顺利开展，如遇到严重吸附污染，则需要仪器厂商高效协同解决；

（3）生物基质干扰严重，需要优选色谱柱，优化良好的梯度条件，与基质中多种干扰物的分离，确保数据科学准确；

（4）色谱柱消耗量大，色谱柱需要老化和平衡冲洗，确保同一PN序列号色谱柱各分析批及不同PN序列号色谱柱重现性及分析批的成功；

（5）样品处理过程需要特殊的方法，提高回收率，保证信号稳定可重现，样品处理全程需要特殊试剂进行抗吸附，否则线性等指标很难成功；

（6）项目运行过程需要高级别项目负责人及操作经验熟练分析人员密切配合才能顺利进行。

经典案例一

甘精胰岛素由53个氨基酸组成，分子量为6063 Da，用于治疗2型糖尿病。在体内可转化为有活性的代谢产物M1和M2。若采用放射免疫分析法，无法区分原型和代谢物。阳光德美质谱平台技术团队采用Waters TQ-XS则可对原型和代谢物进行定量分析。通过设置正离子扫描模式、MRM检测方式以及离子对进行定量检测。另外采用特殊溶剂以解决非特异性吸附的问题。用固相萃取的方法进行前处理，实现了原型和代谢物的灵敏度均达到0.0500 ng/mL。验证结果表明各离子对之间没有相互干扰，特异性好，线性在0.0500~10.0 ng/mL范围内，线性良好，批内批间精密度和准确度均符合要求，没有残留和基质效应，回收率稳定，方法成功地应用于临床样品检测。

▲图3 甘精胰岛素质谱图、色谱图和Waters TQ-XS

▲图4 甘精胰岛素药时曲线图

经典案例二

赖脯胰岛素属于速效人胰岛素类似物，可以用于治疗1型和2型糖尿病。使用成熟高效的UPLC-MS/MS的检测方法，通过设置正离子扫描模式、MRM检测方式以及离子对进行定量检测。采用特殊溶剂以解决非特异性吸附的问题。采用经开发优化的梯度条件，用固相萃取的方法进行前处理，验证结果表明各离子对之间没有相互干扰，特异性好，线性在0.100~80.0 ng/mL范围内，线性良好，批内批间精密度和准确度均符合要求，没有残留和基质效应，回收率稳定。

▲图5 赖脯胰岛素药时曲线图[6](Ly-Lis-JP为参比制剂优泌乐，SAR-Lis为受试制剂）

表2 赖脯胰岛素PK/PD结果[6]

阳光德美在三年前开始建立肽类药物及核酸类药物PK、PD、ADA研究服务平台，从软硬件建设，人员团队能力建设，质量体系建设，项目管理等多维度下功夫，目前已成功开发并实际应用I期临床研究中多种肽类药物方法、反义核酸药物方法，包括在胰岛素类药物的生物分析方面有着丰富的经验。目前在肽类药物及核酸类药物方面服务于国内胰岛素头部企业，国内大型综合型药企的核酸平台品种及多家新型Biotech肽类企业。阳光德美一直秉持着“质量是阳光德美的立身之本，效率是阳光德美的强身之道”的信念。在未来的发展中，阳光德美将一如既往地以科学、高效、准确的精神为指导，领先行业、创誉中外，与社会各界朋友精诚合作，携手奋进，共创生物样品分析领域更加辉煌的明天。

北京阳光德美医药科技有限公司

北京阳光德美医药科技有限公司成立于2016年11月，属于阳光诺和（股票代码：688621）全资子公司，是一家集大/小分子药物分析为一体的、覆盖临床前到临床全链条的PK/PD研究平台和生物分析平台，可为国内外客户提供国际化水准的、以临床价值和患者需求为导向的创新药项目研发服务，包括：药代动力学生物分析服务、免疫原性生物分析服务、药效学和生物标志物研究服务及定量药理学研究服务。专注于解决客户药代药效研究及生物分析中所遇到的挑战，致力于打造国内领先的集大、小分子创新药物临床前以及临床研究于一体的生物分析和PK/PD研究平台。

阳光德美质谱分析平台

●平台介绍：小分子生物分析实验室位于阳光德美中心一实验室，共配备了共有 16台液质联用仪，并采用Watson LIMS和Analyst系统进行全程管理和追踪，系统通用性高，稳定性强，故障率低，充分保障项目的快速检测与数据采集。每年能完成近百个项目，共计几十万个多种类型生物样本。

●服务能力：可提供方法开发、分析方法转移、分析方法验证以及多种基质样品分析以及代谢物鉴定等全方位的服务,为药物研发提供准确而高质量的生物分析数据。

阳光德美免疫分析平台

●平台介绍：实验室拥有多台先进的免疫分析仪器，如Simoa、MSD、ELISA、Luminex、ELISpot。核心技术团队均在医药研发领域拥有近10年的研究经验，行业积累丰富。不仅可提供高质量、高效率、全方位的优质的分析检测服务，还可为客户提供高端定制化解决方案。

●服务能力：可开展药物从临床前到临床各个阶段的药代动力学（PK）、免疫原性、药效学和生物标志物的相关研究，以支持药物发现到IND申报。

阳光德美细胞分析平台

●平台介绍：实验室配备了流式细胞仪，且拥有2间P2级细胞实验室，占地面积约近100平方米。细胞实验室整体环境为万级+局部百级，并配有高效过滤系统及消毒设备，同时制定了科学的管理制度，有力地保证了细胞平台的良好运行，从而确保实验结果的可靠性以及可重现性。

●服务能力：可开展细胞转染、构建，报告基因法、Cell-based ELISA，FCS细胞表型、细胞因子和受体占位检测等业务。

阳光德美分子生物学平台

●平台介绍：阳光德美已经建成独立功能分区的QPCR实验室，分区合理，最大程度地避免交叉污染。实验室配备了Quant Studio系列QPCR和GeneRotex 96核酸提取仪等先进设备。

●服务能力：可提供完整的细胞和基因治疗药物的开发和临床研究。

北京阳光德美医药科技有限公司积累了丰富的PK/PD研究及GLP生物分析经验，在该细分领域奠定了较强的市场影响力。在创新药方面，阳光德美持续加强并向前延伸服务能力，临床药理药代团队积极协同配合企业临床研发部门，在创新药方案设计，临床药理学考量，药代把控，生物样本分类采集、保存、运输，基质稳定性，定量药理学等重要环节为客户提供支持，快速推动创新药项目进度，公司目前正在运行30多项创新药临床前、临床I期项目，包括小分子靶向抑制剂、多肽类、ADC、PDC、单克隆抗体、干细胞产品、核酸药物、疫苗产品、病毒产品、中药创新药等，适应症包括：肿瘤、免疫、心血管疾病、降压、降糖、抑酸、脑卒中、干眼症、中重度肠炎、流感、HIV等，其中高效推进两项创新药项目免二进三，一项国内自主知识产权P-CAB创新药待批准上市。仿制药方面：尤其擅长内源性药物、吸入制剂药物、手性药物、肽类药物、核酸类药物、ADC药物及多化合物及不稳定药物检测。公司自主开发近400 个生物分析方法。已完成近几百项共上百个品种的 BE 项目的生物分析，其中近50个项目顺利通过国家药品监督管理局审核查验中心现场核查及免核查，15 个项目、13 个品种获得生产批件，包括2个首仿制剂（缬沙坦/氨氯地平片，缬沙坦氢氯噻嗪片）及1个罕见病制剂（注射用丹曲林钠）。

参考文献：

[1] 董玲玲. 糖尿病药物的分类及特点[J]. 基层医学论坛, 2013(8):2.

[2] Shen Y, Prinyawiwatkul W, Xu Z. Insulin: a review of analytical methods[J]. Analyst, 2019, 144(14): 4139-4148.

[3]Hilgenfeld R, Seipke G, Berchtold H, et al. The evolution of insulin glargine and its continuing contribution to diabetes care[J]. Drugs, 2014, 74(8): 911-927.

[4] Clements J N, Threatt T, Ward E, et al. Clinical pharmacokinetics and pharmacodynamics of insulin glargine 300 U/mL[J]. Clinical pharmacokinetics, 2017, 56(5): 449-458.

[5] Xu Y, Prohn M, Cai X, et al. Direct comparison of radioimmunoassay and LC–MS/MS for PK assessment of insulin glargine in clinical development[J]. Bioanalysis, 2014, 6(24): 3311-3323.

[6] Shiramoto M, Yoshihara T, Schmider W, et al. Similar Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Biosimilar SAR342434 Insulin Lispro and Japan‐Approved Humalog Insulin Lispro in Healthy Japanese Subjects[J]. Clinical Pharmacology in Drug Development, 2022.