肽类药物的PK/PD及ADA研究

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前言

多肽是由氨基酸通过肽键连接形成的化合物。多肽药物长度一般小于100个氨基酸，分子量不超过10000 Da。FDA发布的BPCI法案“被视为许可”条款问答[1]中明确由α-氨基酸构成的大于40个氨基酸的特定序列则按照生物制品（BLA）进行申报。多肽药物一般来源于自然产生的肽激素(称为生物活性肽)、基因组/重组文库和化学文库[2]。多肽具有与蛋白质和抗体不同的理化性质和治疗特性，除了基于肽的天然激素类似物外，多肽作为候选药物可以破坏蛋白-蛋白相互作用（PPIs）、与细胞表面受体结合，激活或者抑制细胞内信号通路（如受体酪氨酸激酶），这些应用使多肽具有广泛的临床应用价值，肽疗法已经成为近年医药产业中的主导产业之一[3]。目前肽疗法已经开发并应用于抗生素/抗真菌疾病、病毒适应症、免疫系统紊乱、心血管疾病、神经系统紊乱和癌症等领域[4]。本文将从多肽药物的优势、研究进展、研发面临的挑战和解决策略、多肽药物的药代动力学和生物分析几个方面进行阐述。

多肽药物的优势

与蛋白或抗体相比较而言，多肽药物分子量较小，具有进一步渗透到组织中的潜力。另外，多肽药物，包括合成肽，通常要比重组蛋白或者抗体的免疫原性更低[5]。多肽作为候选药物，与蛋白和抗体相比，其具有生产成本低（合成与重组相比较而言）、单位活性更高等特点[6]。

与有机小分子相比，多肽药物具有更强的效力、选择性和特异性。肽的降解产物是氨基酸，从而最大限度地降低了系统毒性的风险（最大限度地减少药物相互作用）[7]。另外，多肽的半衰期较短，组织中肽的积累量较低，从而减少其代谢产物引起并发症的风险。大多数治疗性肽主要来源于天然肽，属于受体激动剂。一般来说，少量的肽激动剂足以激活靶向受体[6]。

多肽药物的研究进展

第一个多肽药物是胰岛素，从牛和猪的胰腺中提取。1954年，文森特·杜·维尼奥（Vincent du Vigneaud）的团队首次通过化学方法合成了多肽，发表了催产素和抗利尿激素的合成过程（1955年获得诺贝尔化学奖）。多肽药物发展中另一个具有里程碑意义的事件是Bruce Merrifield于1963年提出了通过在固相上组装氨基酸来自动合成多肽的方法，即固相多肽合成方法（SPPS）（1984年获得诺贝尔化学奖）。20世纪80年代重组技术的出现使分子量较大的多肽药物的清洁生产成为可能。随后，与脂质、大分子蛋白和聚乙二醇结合来增加肽的分子量的技术发展使多肽药物进一步克服了肾清除率的问题，增加了多肽药物的血浆循环时间。显示技术，如噬菌体显示，有助于研究人员从庞大的肽库中靶向筛选潜在的可成药多肽。Flexizyme技术可以将非天然氨基酸纳入多肽展示库中，构建多样的多肽。另外，天然肽的发现，尤其是从毒液中提取的肽，以及新化学方法都推动了多肽药物的发展[8]。

图1 多肽药物发展历程及代表性多肽药物[8]

多肽药物的发展势不可挡，在过去的六十多年中获批的多肽药物数量呈稳步增长，且其市场约占全球医药市场的5%。2021年日本PMDA批准的新药中有2个多肽药物。2021年欧洲EMA批准的多肽药物有6个，其中4个为创新药。美国FDA药品评价和研究中心（CDER）2021年批准的50个新药中有6个多肽新药。目前获批的多肽药物大多为受体激动剂，其适应症主要涉及内分泌、代谢、肿瘤、中枢神经系统等领域[8]。

我国多肽药物的发展起步较晚，但发展迅猛。国内本土的多肽企业已有上百家。在仿制药方面，多个多肽药物重磅品种的专利已到期，国内多家企业已开始投入大量资源进行仿制研究。中国在多肽创新药方面也有了长足发展。从市场分布来看，我国已上市多肽药物有40余种，在研多肽创新药多达80项，涉及免疫、消化道、抗肿瘤、骨科、产科、糖尿病和心血管等七大领域，市场销售增长迅猛。

多肽药物研发面临的挑战及解决策略

多肽药物的部分特性阻碍了其在治疗领域中的应用。多肽作为治疗药物的瓶颈主要表现在以下几点[2]：

（1）生物利用度较低、体内半衰期短。首先，多肽的亲水性导致其很难穿越生理屏障，穿透细胞膜。另外，消化系统及血液中的蛋白酶可以快速降解多肽，肝脏代谢和肾脏代谢也可在几分钟内快速清除循环中的多肽，使得多肽表现出较短的半衰期和较快的清除率。通常情况需要频繁注射给药来维持血药浓度，但同时会导致血药浓度的波动。

（2）链状多肽过于灵活，可以随意扭曲和翻转，构象灵活性高，导致其生物特异性分布较差，有时可能会导致多肽受体选择性较差，进而导致药物副作用的产生。

（3）多肽药物的变性、聚集、吸附或沉淀影响其储存和使用。多肽的二级结构或三级结构的破坏与其变性有关，变性后的多肽更易发生化学反应，使其活性难以恢复。变性过程产生的中间体易发生聚集，产生聚集体。同时，多肽的表面吸附也是其储存和使用过程的需要面临的问题。多肽的变性、聚集、吸附等特性都会影响多肽药物的血药浓度和其功能的发挥。

面对胃肠道、血液及组织蛋白酶、肽酶的降解以及肝肾循环的快速清除，多肽药物的生物稳定性和半衰期是亟待解决的首要问题。目前，已经有多种技术已应用于提高多肽药物在体内的滞留时间，提高多肽药物的生物利用度和延长半衰期。增强多肽药物体内稳定性的方法包括多肽PEG化修饰，多肽与人IgG的恒定区域Fc段融合，与白蛋白、脚手架蛋白等稳定、丰富的人源化蛋白结合，采用纳米颗粒或微球的封装等[2]。如多肽的PEG化修饰可以增加多肽药物的体积、流体力学半径以及分子量，避免多肽药物被肾脏过滤清除，减少肽链外切酶的降解，增强多肽的体内稳定性。另外，虽然PEG化修饰可能会影响多肽发挥其功能，但可能降低其免疫原性。多肽与人IgG的恒定区域Fc区域融合后可通过结合新生儿Fc受体（neonatal Fc receptor , FcRn)而免受降解。Fc区域融合多肽药物AMG 531（Amgen公司开发）及Fc区域融合蛋白药物Enbrel®, Amevive® and Orencia®都已经成功上市[9]。

多肽的化学修饰等技术也被广泛应用。该技术是通过减少药物在组织和血清中被蛋白酶和肽酶降解来增加其蛋白酶抗性，从而增强其体外稳定性[2]。多肽的化学修饰方法包括C-末端酰胺化，N -末端乙酰化、加入非天然氨基酸或磷酸化氨基酸、线性多肽二硫键的环化等。如二硫键环化降低线性多肽的高构象灵活性，提高其蛋白水解稳定性[10]。此外，增加多肽的体外稳定性还可以通过添加不同作用机制的稳定剂来实现，如添加糖（蔗糖、麦芽糖、海藻糖或葡萄糖）、盐（磷酸钾、硫酸铵或柠檬酸钠）或肝素钠来减少多肽聚集，调节溶解性，增加多肽的稳定性[11]。添加的螯合剂，如EDTA，可与金属依赖的蛋白酶/肽酶形成络合物，从而抑制多肽的降解[12]。此外，非离子表面活性剂（Pluronic F68）可以稳定多肽和蛋白质，防止自身聚集。另一方面，阴离子（SDS）和阳离子（溴棕三甲铵）表面活性剂可以促进多肽穿过细胞膜，从而促进多肽的吸收[13]。

图2 多肽药物的化学修饰策略[8]

多肽药物的药代动力学

由于蛋白酶和肽酶的降解作用，多肽药物的半衰期通常较短。内源性多肽（通常具有激素活性）的消除半衰期极短，作为潜在的治疗手段，主要的关注点在于调控其内源性浓度和功能。例如，胰高血糖素样肽-1 （GLP-1）可以降低糖尿病患者的血糖，是一种潜在的2型糖尿病治疗手段。然而，它在体内的半衰期小于2分钟，因此在应用过程需要频繁和高剂量给药。这促进了长效抗肽酶GLP-1类似物的开发，如艾塞那肽和利拉鲁肽[14]，它们的半衰期分别为2.5和13小时。

5.1 吸收

（1）注射给药

静脉给药可避免肝脏和胃肠道酶首过代谢，因此，它是多肽药物最常见的给药方式。[15]。

除静脉给药外，多肽药物其他常见的肠外给药方式包括皮下注射给药和和肌肉注射给药。与静脉给药相似，皮下注射和肌肉注射给药同样可以使多肽药物避开肝脏和胃肠酶的降解。但由于无法避免注射部位细胞间隙中蛋白酶和肽酶的首过代谢以及淋巴系统的降解[16]，使得药物皮下注射和肌肉注射给药方式的生物利用度低于静脉给药[15]。多肽药物的皮下注射和肌肉注射给药方式的系统生物利用度差异较大，20%~100%均有报道。皮下注射和肌肉注射的部位的血液和淋巴循环的差异均会影响多肽药物的药代动力学特征[17]。皮下和肌肉注射的药物吸收具有很强的分子依赖性。多肽药物通过皮下或肌肉注射后，可以通过毛细血管或淋巴管进入体循环。随着药物分子量的增加，药物通过组织间液的对流转运进入淋巴系统的吸收的比例随之增加，淋巴系统的吸收是治疗性蛋白大分子药物的主要吸收方式。皮下注射后，1 kDa以下的药物主要被毛细血管吸收，而16~22 kDa以上的蛋白质则主要通过淋巴系统吸收。大部分治疗性肽的分子量在1到10 kDa之间，一般同时通过淋巴系统和血管进行吸收，但通过对流转运过程被淋巴系统吸收的药物通常是有限的。扩散作用进入毛细血管是大多多肽药物的主要吸收方式[14]。

（2）非侵入性给药

多肽药物的非侵入性给药途径包括口服、颊部、肺、鼻内和经皮给药，这些途径与注射给药相比，操作方便、给药方式更温和，患者依从性好。但多肽药物一般具有亲水性并有多个带电基团，无法通过被动扩散通过上皮细胞，并且分子量通常大于700 Da，很难通过细胞旁途径吸收（仅限于小于200 Da的化合物吸收），这导致大部分多肽的渗透性较差，肽分子质量超过700 Da的阈值时，生物利用度急剧下降。这也是多肽药物通过口服或其他非侵入性方式给药所面临的巨大挑战[14]。

目前已经上市的口服多肽药物较少，它们具有独特的化学特性。其中一种口服肽是环孢素，它含有11个氨基酸的小环肽。环孢素的环状结构有助于保护其不受蛋白内肽酶的水解，其亲脂性有利于其通过肠粘膜[18]。环孢素独特的化学性质将其口服生物利用度提升至30%（Sandimmune® Oral），另一种新的环孢素（Neoral®）使用微乳化技术，其生物利用度达到约40%[19]。另外，氨基酸主链修饰、与疏水或靶向配体的化学偶联，以及使用促吸收剂等可以促进口服多肽的吸收。如，口服索马鲁肽采用Eligen®技术，通过与促吸收剂SNAC形成复合物，一方面避免索马鲁肽受到胃酸影响而失活，另一方面促进索马鲁肽在胃部快速吸收，从而提高索马鲁肽的口服生物利用度。

多肽药物口腔给药，使药物通过颊及舌下区丰富的毛细血管和淋巴管吸收，绕过肝脏和胃肠道首过代谢。

多肽的肺部吸入给药具有无创给药的优点，且肺部吸收表面积大，给药部位血管密度高，药物吸收迅速并可绕过肝脏的首过效应[14]。但肺泡内衬液、肺泡巨噬细胞和肺泡上皮构成了多肽的吸收屏障，阻碍药物渗透进入体循环，影响细胞摄取[18]。

多肽鼻腔吸入给药与肺部吸入给药的优点相似：表面积大、血管丰富，可避免肝脏首过效应，药物的吸收迅速。鼻上皮细胞具有较高的渗透性，允许较大分子的渗透（分子量阈值约1000 Da）[14]。但鼻腔吸入给药的药物生物利用度依然较低，如鼻腔吸入给药的多肽药物Miacalcin®, Synarel®和 DDAVP®，其生物利用度约等于或小于3%[18]。

多肽经皮给药的优点除了可以避免肝脏和胃肠道代谢的首过效应外，还可以持续将药物释放进入体循环。经皮给药的主要缺点是大多数亲脂药物很难透过皮肤，经皮给药仅适用于少数药物。超声法（低频超声）和离子导入法（低电流）是增强皮肤通透性的两种常用方法，经皮给药非常适用于以极低剂量持续释放进入体循环的多肽药物，包括GnRH类似物和血管加压素[20]。

5.2 分布

药物分布的速度和范围由组织的渗透速率和范围、组织内的分布情况以及组织对药物排泄决定。对于某一种特定的药物，其分布的速度和范围取决于其理化性质（如大小、电荷、亲脂性）、蛋白结合以及对载体介导转运的依赖性。小分子药物的分布主要是通过浓度梯度驱动的被动扩散。而大分子药物，如蛋白药物主要是通过对流转运方式从脉管系统进入细胞间隙，在细胞间隙中分布并最终转运出组织进入毛细血管。由于肽的大小介于小分子和大分子之间，多肽药物的分布过程包括扩散和对流转运方式，其大小和结构决定了其分布过程所采取的转运方式[17]。

肽的分布容积通常比较小，仅局限于细胞外间隙。静脉注射的多肽药物通常为双指数血药浓度-时间分布。中央腔室（V1）一般为3~8 L，略大于血浆体积，组织（尤其在肾脏和肝脏中）灌注良好，毛细血管膜具有良好的通透性。外周室灌注效果不佳。多肽药物的稳态分布容积（Vss）通常略大于细胞间液容积（70公斤个体约为15升） [21]。例如，糖蛋白IIb/IIIa抑制剂eptifiatide（环七肽）的V1为9.2 L[22]，生长抑素类似物奥曲肽（环八肽）的V1为5.2~10.2 L，Vss为18~30 L[21]。此外，与内源性蛋白质的结合会影响治疗性肽的分布，例如，65%的奥曲肽与脂蛋白结合，超过98%的GLP-1类似物利拉鲁肽与可血浆蛋白结合。

5.3 代谢和排泄

多肽药物的代谢途径通常与内源性多肽的代谢途径相同，代谢产生的氨基酸在内源性氨基酸库中被重新利用，用于蛋白质/肽的从头合成[23]。血液、肝脏、肾脏和小肠可能是多肽药物降解的重要部位，因为它们富含各种蛋白酶和肽酶。但由于体内的蛋白酶和肽酶无处不在，体内其他各组织中也都存在多肽的降解。

对于大多数多肽药物来说，肝脏不是主要的代谢途径。但一些分子量较小的多肽药物主要通过肝脏代谢。例如蛋白酶体抑制剂硼替佐米，一种治疗多发性骨髓瘤的二肽，在肝脏中发生氧化代谢。最近的一项研究表明，中度或重度肝损害的患者硼替佐米的清除率降低，因此应该减少患者起始用药剂量。同样，环十一肽环孢素几乎可以完全被肝脏代谢消除[17]。

对于大多数多肽来说，通过非代谢途径（如肾脏、胆道排泄）排出体外的量几乎可以忽略不计。但通常情况下，小于10 kDa的多肽可被肾小球过滤，然后在近端小管细胞刷状边缘被降解。多肽药物的分子量通常都在10 kDa以下，其肾脏清除率接近肾小球的滤过效率[17]。大多数多肽半衰期非常短的现象不能用肾小球的滤过速度来解释，而更像是快速降解的结果。而对于具有蛋白酶抗性的多肽来说，肾脏的清除可能是其排泄的主要途径。例如，艾塞那肽是39个氨基酸的GLP-1的类似物，可以抵抗二肽基肽酶-4的降解，其主要排泄途径是肾小球的滤过和肾小管细胞膜的酶降解作用，其在人体内的半衰期约为2.5 h，明显长于GLP-1（2分钟） [24]。

多肽药物的生物分析

6.1 PK研究

随着蛋白质组学领域的成熟、多肽药物的发展，各种定量分析方法也得到了发展。准确可靠的定量分析方法在药物开发和研究中发挥着关键作用。目前，蛋白或多肽药物的生物分析方法包括：同位素标记示踪法、活体成像技术、免疫分析法、色谱法、高效毛细管电泳等。同位素标记示踪法测定过程稳定、检测限度极低、操作过程简单，尤其是放射性同位素标记法适用于蛋白或多肽药物的组织分布及排泄研究。活体成像技术适用于活体状态下对药物进行组织及细胞水平研究。免疫分析是蛋白和多肽分析中，具有高灵敏度及准确性的分析方法之一，与色谱-质谱技术相比，可以实现更高的灵敏度，且更容易实现自动化操作[25]。液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）因其特异性强、方法开发速度快、具有多重分析能力等优点，已成为生物治疗药物生物分析的重要平台之一[26]。

6.1.1 免疫分析技术

免疫分析技术中的酶联免疫法是蛋白和多肽药物药代研究普遍采用的方法，方法操作简单、快速，特异性良好，可实现高通量检测。而电化学发光法提高了分析的灵敏度，可实现自动化操作。Quanterix的数字式单分子免疫阵列技术（Simoa）灵敏度可以达到fg级别，被广泛应用于创新药临床前及临床试验中的PK、PD、生物标志物研究。

表1方法验证指标

标准曲线	选择性
特异性	残留
精密度准确度	稀释线性和钩状效应
平行性	稳定性

但免疫分析方法也存在不足：分析过程中使用的抗体与药物的代谢产物有不同程度的交叉反应，翻译后修饰往往不能被识别。这些是蛋白质或多肽疗法中特殊问题，药物代谢产物可能有活性，也可能没有活性，但在结构上非常类似于检测靶肽或靶蛋白[25]。另外，免疫分析方法的定量范围有限。近年来，随着样品制备技术、色谱及质谱软硬件的发展，使LC-MS/MS逐渐成为蛋白及多肽分析中的重要技术平台，并可弥补免疫分析中的不足[27]。

6.1.2 色谱-质谱/质谱联用技术（LC-MS/MS）

对于分子量较大的多肽药物，通常选择使用蛋白酶消化的替代肽段来进行定量分析，分子量较小的替代肽段使分析方法获得更低的灵敏度和特异性。替代肽法的主要过程包括：样品前处理、蛋白或多肽的蛋白酶消化、多肽片段富集、液相及质谱分析。

对于分子量较小的多肽，通常直接定量完整多肽药物本身，而不使用替代肽法。另外，随着LC-MS/MS检测大分子设备的改进，定量完整肽成为趋势，以避免蛋白酶消化过程中引入的变异和干扰。Bronsema等[28]分别使用替代肽法和完整肽定量方法对鲑鱼降钙素进行定量分析，结果表明未经消化的样品的LLOQ比消化后样品低约5倍。这是因为消化过程增加了样品的复杂性，从而干扰了特征肽的定量。使用完整多肽进行定量分析的另外一个原因在于，替代肽可能不能完全代表未经处理的完整多肽分子，特别是蛋白水解作用产生的替代肽[26]。

表2 2015年后使用完整肽进行定量的多肽药物[26]

LC-MS\MS分析方法验证指标包括标准曲线、选择性和特异性、精密度准确度等。虽然LC-MS\MS分析方法是蛋白或多肽定量的重要分析平台之一，但仍然存在诸多挑战，如样品制备过程中须去除其他样品基质干扰物质，提高检测的特异性。考虑的因素包括样品净化过程中的蛋白结合、非特异性结合、肽的溶解性、肽的特异性以及实现可重复的高回收率等。

表3 方法验证指标

标准曲线	基质效应
选择性和特异性	残留
精密度准确度	定量下限
提取回收率	稀释可靠性
分析批容量	稳定性
处理后重进样重现性

案例一

去氨加压素是人工合成的加压素类似物,分子量1069 Da，它的主要作用是抗利尿，在临床上常用于治疗神经垂体功能不足引起的中枢性尿崩症。在其临床PK研究中，阳光德美采用液质联用仪（Waters TQ-XS）检测了给药后健康受试者的血浆中药物浓度。该药具有一定的系统残留，经过优化流动相、稀释液及源参数等，最终选择了[M+2H]2+的电荷态作为定量母离子，并采用甲酸铵体系的液相条件和固相萃取的前处理方法，定量限达到1.00 ng/mL。

图3 去氨加压素的质谱图、色谱图及药时曲线图

案例二

某注射用小肽类创新药物，分子量约2000 Da。在其临床I期研究中，北京阳光德美采用液质联用仪（Triple Quad 5500）开发并验证了高特异性、高灵敏度的定量分析方法以检测血浆中的药物浓度。该药物本身具有非特异性吸附致使方法残留严重，此外样品稳定性差，半衰期短。在方法开发过程中为克服上述困难，阳光德美引入内洗外洗加强洗方法及特殊的洗脱试剂解决了残留问题。此外，通过蛋白酶抑制剂的加入使样品稳定性得以改善，血样从采集、存储、转运到分析结束，待测物均可保持稳定。在血浆用量仅50 μL的情况下，首个爬坡剂量组的峰浓度后仍有至少5个浓度点参与到药代动力学参数的计算，为临床研究提供了准确、可靠的数据支持。

图4 某注射用小肽类创新药I期临床PK样品分析（A 药物非特异性吸附导致残留严重；B 强洗并使用特殊洗脱试剂后的残留；C定量下限；D药时曲线）

案例三

某眼科多肽药物，分子量约5000 Da，是一个内源性多肽药物。在其临床前PK研究中，阳光德美采用液质联用仪（Triple Quad 5500）同时检测了给药后家兔体内的血浆中药物浓度及眼组织中药物浓度。该药具有极强的非特异性吸附、内源性干扰大且不稳定的特点，由于系统暴露量低，对方法的灵敏度要求极高。经过优化流动相、稀释液及源参数等，最终选择了[M+7H]7+的电荷态作为定量母离子，并采用乙酸体系的液相条件和固相萃取的前处理方法，最终灵敏度达到0.100 ng/mL；同时采用在血浆样品中添加蛋白酶抑制剂作为稳定剂的方法，实现了样品的长期保存。

图5 眼科创新多肽药物临床前PK分析

（A定量下限；B标准曲线；C血浆及各组织的药时曲线）

案例四

STC007为成都诺和晟泰自主研发的1类创新型多肽类κ阿片样物质受体（KOR）激动剂，其对KOR受体具有较强结合力，表现出良好的瘙痒治疗效果，具有自主知识产权，核心化合物中国发明专利已获得授权，PCT专利进入国际公布阶段，该化合物核心专利已布局美国、欧洲等国家或地区。本品的开发可满足患者临床需求，将带来较大的市场价值。

北京阳光德美医药科技有限公司PK/PD研究服务综合性平台正在开展该药的人体血、尿、粪中药物及其主要代谢产物的PK分析，同时开展该药的免疫原性研究，为该药的药效及安全性研究提供强有力的数据支持。

案例五

甘精胰岛素是一种用于治疗2型糖尿病的多肽药物，由53个氨基酸组成，分子量为6063 Da，用于治疗2型糖尿病,在体内可转化为有活性的代谢产物M1和M2。若采用放射免疫分析法，无法区分原型和代谢物。阳光德美质谱平台技术团队采用Waters TQ-XS则可对原型和代谢物进行定量分析。通过设置正离子扫描模式、MRM检测方式以及离子对进行定量检测。另外采用特殊溶剂以解决非特异性吸附的问题。用固相萃取的方法进行前处理，实现了原型和代谢物的灵敏度均达到0.0500 ng/mL。验证结果表明各离子对之间没有相互干扰，特异性好，线性在0.0500~10.0 ng/mL范围内，线性良好，批内批间精密度和准确度均符合要求，没有残留和基质效应，回收率稳定，方法成功地应用于临床样品检测。

图6 甘精胰岛素质谱图、色谱图和Waters TQ-XS

图7 甘精胰岛素药时曲线图

UPLC-MS/MS方法的技术难点

该类项目对实验室质谱平台的综合能力提出了巨大挑战：

（1）首先是对于仪器系统整体性能、稳定性及灵敏度有很高要求，该类药物质谱多电荷带电，特殊的流动性条件致使信号响应低，所以仪器灵敏度要高且信号稳定，强吸附性需要仪器液相系统硬件有抗吸附功能，否则残留无法通过；

（2）该类化合物吸附性严重，在方法验证及样品分析过程中，仪器清洗维护至关重要，设备管理人员需要敏锐观测仪器信号稳定性，密切配合项目组及时清洗重要配件，才能保证项目顺利开展，如遇到严重吸附污染，则需要仪器厂商高效协同解决；

（3）生物基质干扰严重，需要优选色谱柱，优化良好的梯度条件，与基质中多种干扰物的分离，确保数据科学准确；

（4）色谱柱消耗量大，色谱柱需要老化和平衡冲洗，确保同一PN序列号色谱柱各分析批及不同PN序列号色谱柱重现性及分析批的成功；

（5）样品处理过程需要特殊的方法，提高回收率，保证信号稳定可重现，样品处理全程需要特殊试剂进行抗吸附，否则线性等指标很难成功；

（6）项目运行过程需要高级别项目负责人及操作经验熟练分析人员密切配合才能顺利进行。

6.2 免疫原性分析

多肽药物的免疫原性通常是指多肽药物和/或其代谢物诱发对自身或相关蛋白的免疫应答或免疫相关事件的能力。免疫原性评估是评价生物制剂药物如蛋白药物和多肽药物安全性的一个重要方面。在反复或长期给药后，通常会导致抗药物抗体（ADA）的产生[29]。ADA的产生不仅可以调节甚至消除治疗药物的生物活性（中和抗体），而且还可能改变其药代动力学特征[17]。免疫原性相关的安全问题包括可能引起超敏反应或过敏性反应、中和抗体的组织交叉反应、免疫复合物在特定组织或器官沉积后介导的毒性反应[30]。

通常认为分子量小于4000 Da的小肽具有低免疫原性，但人类免疫反应系统复杂也有例外情况。例如，降糖药他司鲁泰（Taspoglutide）是基于人类序列的GLP-1类似物，因严重的超敏反应（发生概率不足1%）而终止研发[31]。

另外，药物的给药途径可能影响其免疫原性，虽然给药途径不能直接改变多肽或蛋白的免疫原性特性，但它可以增加具有免疫原性的多肽或蛋白产生免疫反应的概率。一般而言，给予相同药物的情况下，皮下给药与肌肉或静脉给药相比，皮下给药部位蛋白聚集物形成的可能性增加，从而使免疫反应发生率更高[32]。

降低多肽药物免疫原性的方法包括避免多肽氨基酸序列中出现的抗原序列、多肽结构修饰(如糖基化或PEG化)，通过空间位阻屏蔽药物的抗原决定簇，使其不被免疫系统识别[16]。例如，蜂舒缓激糖肽（vespulakinin 1, VSK1）的免疫原性在碳水化合物附着时显著降低[33]。

抗药抗体的检测策略通常采用多层级分析方法，包括筛选试验、确证实验、滴度试验和中和活性检测。

图8 免疫原性多层级检测策略[34]

方法验证指标包括临界值、灵敏度、精密度、药物耐受等。

表4免疫原性验证指标

临界值（筛选临界值、确证临界值）	灵敏度
药物耐受	精密度（筛选精密度、确证精密度、滴度精密度）
特异性	选择性
钩状效应	稳定性
重现性	稳健性

用于评价免疫原性抗药抗体检测的分析方法包括ELISA，表面等离子体共振（SPR）、（电）化学发光、基于流式细胞术的CBA（Cytometric Bead Array）技术以及基于细胞技术的中和抗体检测等。由于免疫反应的复杂性，往往需要结合不同的技术手段才能充分评估药物的免疫原性[35]。

图9 抗药抗体检测方法及相应检测技术[35]

结合抗体检测方法已经较为成熟，但分析过程中仍存在诸多难点需要应对，如部分多肽类药物因分子量过小而无法直接包被板；基质（如血清）成分复杂，基质中的多种免疫球蛋白可能影响对目标抗体的捕获，从而影响检测性能；在直接或间接免疫分析中使用的标记二抗也可能与非目的抗体发生非特异反应，导致反应本底过高。此外，链状多肽过于灵活，可以随意扭曲和翻转，很难使用经典的免疫方法进行分析等等。

案例

北京阳光德美对某注射用小肽类创新药物的临床I期研究样品进行了免疫原性分析。该药物分子量较小，无法采用常规免疫分析方法进行检测，最终北京阳光德美秉承自主创新、攻坚克难，开发了经典ELISA平台结合酸解离的方法进行药物抗药抗体的测定，该方法的灵敏度可达10 ng/mL，远远低于法规要求，且该方法精密度高、药物耐受性强，突破性地解决了小分子量药物无法进行药物抗药抗体检测的难题，为临床研究奠定了坚实基础。

图10 筛选试验和确证试验的灵敏度结果

展望

多肽药物因其高生物活性、毒副作用小等特点，成为国际医药研发的热点，得到了长足发展。国内医药企业顺势而发，争相投入到多肽药物的研发中，但多肽药物的药代/药效以及理化性质的复杂性无疑给多肽药物的研发带来挑战，目前尚无一种分析方法可以完全满足多肽药物药代研究的所有要求。多肽药物的药代/药效以及生物分析需要多学科领域人才团队及多个技术检测平台相互补充配合完成。随着行业对多肽药物药代/药效以及生物分析特点认知逐渐深入和完善，必将会促进多肽药物的研发，为临床合理用药提供重要的科学依据。

阳光德美自2018年开始建立肽类药物及核酸类药物PK、PD、ADA研究服务平台，从软硬件建设，人员团队能力建设，质量体系建设，项目管理等多维度下功夫，目前已成功开发并实际应用I期临床研究中多种肽类药物方法、反义核酸药物方法，包括在胰岛素类药物的生物分析方面有着丰富的经验。目前在肽类药物及核酸类药物方面服务于国内胰岛素头部企业，国内大型综合型药企的核酸平台品种及多家新型Biotech肽类企业。阳光德美一直秉持着“质量是阳光德美的立身之本，效率是阳光德美的强身之道”的信念。在未来的发展中，阳光德美将一如既往地以科学、高效、准确的精神为指导，领先行业、创誉中外，与社会各界朋友精诚合作，携手奋进，共创生物样品分析领域更加辉煌的明天。

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北京阳光德美医药科技有限公司

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