关键词：角质层、胶带剥离法、局部用药物、生物等效性、药代动力学
对于皮肤局部用药物的有效性和安全性而言，评价皮肤靶部位药物浓度的动态变化过程具有重要价值。目前，皮肤局部用药物的生物利用度要求取决于药物的药理学分类。除糖皮质激素类建议采用皮肤变白试验（或称血管收缩测定法）之外，一些皮肤局部用药物还要求通过仿制药和原研药的临床对比试验开展生物等效性评价，即临床终点生物等效性研究。但是，此类试验往往需要数百例受试者，既费时且费用昂贵。此外，EMA和PMDA还支持皮肤药代动力学生物等效性（以下简称DPK-BE），即胶带剥离法，尤其在日本的应用最为广泛。其他研究方法如皮肤微透析、开流微量灌注及体外研究方法等研究和应用日益广泛，并有望成为皮肤局部用药物生物等效性和生物利用度的可行性手段。
先宁医药自成立以来，始终致力于皮肤局部用药物的临床研究，通过查阅FDA、EMA、PMDA及NMPA相关的指导原则，并参考多个国外已上市局部用药物仿制药的等效性研究文献，我们初步了解了局部用药物的DPK-BE研究方法。除此之外，我们还使用某外用凝胶剂和某凝胶贴膏剂探索性研究了DPK-BE。在我们先前撰写的《共同探讨|角质层胶带剥离法-局部用药物BE评价新方法》一文中，介绍了局部用药物的理论机制和相关指导原则。在本文中，我们将总结先前探索性研究中获得的经验并对研究过程中出现的问题进行思考，浅谈局部用药物DPK-BE研究的方案设计思路和试验实践要点。
DPK-BE研究在进行受试者选择时，原则上是选用适合试验且皮肤状态健康的志愿者。适合试验的健康皮肤状态，通常来说，包括以下状态：
a)PMDA的指导原则中建议可选择背部、胸部、前臂等适宜部位，日本既往研究中通常选择背部为给药及取样部位。EMA的指导原则中推荐使用前臂进行研究。
注：在先宁医药团队的探索中发现，手臂内侧的角质层与背部相比较薄，进行角质层剥离后，更易出现渗液、泛红等现象，且手臂内侧的角质层药物吸收含量低于背部，故更推荐选择背部作为研究部位。为便于操作，更推荐选择男性志愿者进行研究。
b)除非产品有明确的用法，否则制剂用药部位不可以用密封型敷料或器具覆盖。在试验操作过程中，如给药部位有被外界物质或受试者行为影响的可能性，可以在用药部位用非密封型敷料或器具进行保护。
图1 给药部位设计示意图
a)剂量：根据相关指导原则和既往研究、文献确认给药剂量，以预定剂量（±5%）涂抹，并均匀涂抹在整个规划的涂抹区域。
b)根据剂量和涂抹面积选择合适的涂抹工具，制定给药SOP，规范操作流程。
c)关于给药前受试者皮肤的清洁，PMDA指导原则提到“在试验开始前，应避免皮肤出现物理性损伤或者由表面活性剂和药品等化学性刺激引起的损伤。维持正常环境，用表面活性剂清洗后，为使皮肤恢复到正常状态，需放置充分的时间（通常2小时）。”
注：事实上，受试者之间皮肤状况和既往清洁习惯可能存在较大差异，为避免该差异带来的影响，建议在-1天或给药当天较早的时间，使用温和的清洁产品统一清洗拟给药部位。
a)EMA指导原则：对于每名受试者，有必要在两个时间点（一个摄取时间点，一个清除时间点）对产品进行比较。最佳摄取和清除时间取决于药物和产品的特性，应在中试研究期间确定。理想情况下，当相关时，摄取时间应足够长，使药物达到扩散稳态。这可以通过在多个摄取时间检测以及从角质层中回收的药物质量保持恒定来确定。清除时间应足够长，以允许可测量的药物从角质层转移至活性皮肤（及以上），但不应超过48小时，以避免任何皮肤脱屑效应。首选从角质层回收的药物质量相对于摄取期质量至少降低25%的清除时间。在所有情况下，应仔细考虑采样时间并证明其合理性。
b)PMDA指导原则：关于重复试验，超过稳态时间的数个时间点（制剂应用时间不可变化过大），或者在同一制剂应用时间下有数个用药部位，这些均可以。像软膏那样的制剂没有明确规定用药时间以及用药次数，在适宜给药的药品中，角质层中药物浓度达到稳态时，稳态时点为一个点；未达到稳态，药物浓度持续升高时，在开始给药后大约4小时的时点为一个点；另外，稳态未能持续一定的时间，角质层中药物浓度达到最高值后降低时，在最高值之后的适当时点作为一个点；分别将试验制剂和标准制剂进行比较。
c)综上所述，需要探索角质层中试验药物的稳态时间和清除时间，此探索同样需要在预试验或前期探索阶段完成，为正式试验方案设计提供依据。验证前，可查询相关指导原则和既往文献。
a)角质层剥离的次数：需确保角质层剥离充分，EMA、PMDA指导原则均建议通过TEWL测量等方法验证完整性，按10次~20次的一定次数，或者例如，TEWL达到50g/m2/h时间点之前，用剥离胶带剥离角质层。TEWL的测量方式要求较高，在正式研究中不便于操作，故角质层剥离的数量可在预试验或前期探索时验证。
注：在先宁医药团队探索过程中发现，角质层剥离20次后，TEWL测量值均能够达到50g/m2/h以上，故设计角质层剥离20次能够满足要求。
b)角质层剥离操作SOP：需提前制定角质层剥离操作的SOP，以减少多组研究者之间的操作误差。
注：胶带剥离操作步骤多、耗时长，为规范操作、避免偏差，可在SOP中将操作步骤分解，如残留药物擦除、镊子的清洁和更换、剥离的方向和手法、剥离后的角质层保存方式以及记录都尽数做统一要求。实操前的培训和演练也十分必要。
c)角质层的保存方式：根据操作SOP对剥离后的角质层进行处理、保存及转运。因皮肤上会有试验药物残留，需提前制定残留药物的清除方式，在剥离角质层之前执行该清除程序。通常第1-2片剥离下的角质层也视为药物残留，可不做检测，后续剥离的角质层中的药物含量用作试验分析。
d)采购专业的剥离胶带及压力器等工具进行研究，并设计/采购辅助工具确保给药、取样区域的可控制，以保证给药、取样的均一性。
a)由于药物的生物利用度可能会受到生理节律的影响，或皮肤状态容易受到周围的影响，因此需要稳定的环境及制剂用药条件下进行试验。
b)试验期间的温湿度环境也需要寻找合适、稳定的条件，过高/过低的温度/湿度都将影响药物的吸收和代谢，需要寻找到合适的温湿度条件并严格控制。不同的温湿度环境下采集到的药物含量差异可达到2-10倍。
a)根据活性药物的理化特性，选择适当溶剂和方法提取胶带黏贴角质层中的活性药物，并采用经验证的方法（如LC-MS/MS）定量分析。
b)根据分析方法验证得出的线性范围及定量限，以及预试验获得的角质层药物量数据，确定主试验中的角质层剥离次数及每次测定的剥离胶带数。
Data management and statistical analysis
结合EMA、PMDA局部用药物生物等效性指导原则和NMPA发布的⟪以药动学参数为终点评价指标的化学药物仿制药人体生物等效性研究技术指导原则⟫，暂定DPK-BE的等效性参数的接受标准应为受试制剂和参比制剂药物含量几何均值比值的90%置信区间在80.00-125.00%之间。
根据定量分析获得的角质层药物量（PK数据）进行统计分析。因个体内存在多组数据，分析前，应对每例受试者中每种制剂的重复测量结果取平均值（几何均值）。对受试者PK数据分别列出：n（受试者例数）、算术均值、SD（标准偏差）、几何均值、CV（变异系数）、中位数和药物含量及几何均值等。求取PK数据的对数转换值进行生物等效性统计学分析。
a)EMA指导原则提到“应对从每个给药部位收集的所有剥离胶带进行分析。前两个胶带应与剩余胶带分开分析，因此可评价其对回收药物总量的贡献。为了提高分析可检测性，可将后续胶带组合成一组（例如，每组包含所需的最低SC含量）进行浸提。SC中药物的总质量应计算为从所有胶带样品中提取的总和。应确定每个给药部位的质量平衡，包括通过清洁从表面去除的药物含量。90-110%的总体回收率是可接受的，无需论证；应充分解释较大的变异性。”
除去受试制剂和参比制剂药物含量几何均值比的等效标准之外，物料平衡同样重要，回收的药物含量和涂抹的药物的比值所体现的物料平衡回收率能够帮助我们更全面地分析制剂的吸收情况及制剂间的差异。
b)除受试制剂和参比制剂药物含量的等效评价之外，物料平衡同样重要，回收的药物含量和涂抹的药物的比值所体现的物料平衡回收率能够帮助我们更全面地分析制剂的吸收情况及制剂间的差异。物料平衡的数据可以证明受试制剂与参比制剂在人体皮肤吸收代谢的一致性，我们认为该方法适用于治疗皮肤炎症性药物的一致性评价。
以上为我司在皮肤角质层生物等效性方案设计和试验实践要点中的一些思考。在DPK-BE研究中，有两大要点，其一是方案设计，需要充分考察、探索品种特性以设计科学合理的试验方案；其二是试验期间的操作流程，不同于常规药物的BE研究，DPK-BE的给药和角质层剥离都具有较大的挑战，如何规范、熟练地完成操作并尽量减少多组研究者之间的操作误差，是试验成功的重要保障。
如前文所述，目前，国家药品监督管理局（NMPA）尚未发布支持DPK-BE研究的指导原则，且国内尚无通过DPK-BE批准局部用药物仿制药的先例。故还需医药从业者付诸努力，提供可靠的理论依据以证明该方法的可行性。
先宁医药是一家致力于外用制剂临床研究的CRO公司，我们积累了一些局部用药物品种的临床评价经验，品种包括阿达帕林凝胶、夫西地酸乳膏、克立硼罗软膏、过氧苯甲酰凝胶、甲硝唑凝胶、洛索洛芬钠凝胶贴膏、氟比洛芬凝胶贴膏、利多卡因凝胶贴膏、莫匹罗星等。热忱欢迎业界同行与我们互动交流，共同推进我国局部用药物临床评价的方法建立和标准制定。
参考文献
[1]NMPA. 局部给药局部起效药物临床试验技术指导原则 2022
[2]EMA. Draft guideline on quality and equivalence of topical products2018
[3]PMDA.局所皮膚適用製剤の後発医薬品のための生物学的同等性試験ガイドライン（薬食審査発第1124004号平成18年11月24日，別紙4）
[4]医薬品医療機器総合機構（PMDA）ジェネリック医薬品等審査部小川卓巳. ジェネリツク外用剤の生物学的同等性はどの試験でどう評価されますか？薬局2018 Vol 69, No. 13, 16-21
[5]高柳智子. 医療用粘着テープの剥離方法に関する基礎的研究 :剥離角度による剥離力の変化. 福井医科大学研究雑誌, 第3巻, 25-30
